FastKing RT-PCR komplet u jednom koraku

A-1 RNA je razgrađena

—— Očistite visokokvalitetnu RNK bez kontaminacije. Materijal iz kojeg se ekstrahira RNK treba biti što je moguće svježiji kako bi se spriječila degradacija RNK. Analizirajte integritet RNK na denaturiranom gelu prije RT reakcije. Nakon ekstrakcije RNK, treba je pohraniti u 100% formamidu. Ako se koristi inhibitor RNaze, temperatura zagrijavanja treba biti <45 ° C, a pH manji od 8,0, u suprotnom će inhibitor osloboditi svu vezanu RNazu. Nadalje, inhibitor RNaze treba dodati u otopine koje sadrže ≥ 0,8 mM DTT.

A-2 RNA sadrži inhibitore reakcija obrnute transkripcije

—— Inhibitori obrnute transkripcije uključuju SDS, EDTA, glicerol, natrij pirofosfat, spermidin, formamid, gvanidinsku sol itd. Pomiješajte kontrolnu RNK sa uzorkom i uporedite prinos sa reakcijom kontrolne RNK kako biste provjerili postoji li inhibitor. Operite taloženje RNA sa 70% (v/v) etanola da biste uklonili inhibitore.

A-3 Nedovoljno žarenje prajmera koji se koristi za sintezu prvog lanca cDNA

—— Utvrdite da je temperatura žarenja prikladna za prajmere korištene u eksperimentu. Za slučajne heksamere preporučuje se održavanje temperature na 25 ° C 10 minuta prije postizanja temperature reakcije. Za prajmere specifične za gen (GSP) pokušajte s drugim GSP-om ili prijeđite na oligo (dT) ili slučajni heksamer.

A-4 Mala količina početne RNK

—— Povećajte količinu RNK. Za uzorke RNA manje od 50 ng, 0,1 μg do 0,5 μg acetil BSA može se koristiti u sintezi cDNA prve niti

A-5 Ciljana sekvenca nije izražena u analiziranim tkivima.

—— Probajte druga tkiva.

A-6 PCR reakcija ne uspijeva

——Za dvostupanjski RT-PCR, cDNA šablon u koraku PCR-a ne može premašiti 1/5 reakcijske zapremine.

A-1 Nespecifično žarenje prajmera i šablona

—— 3'-kraj prajmera ne bi trebao sadržavati 2-3 dG ili dC. U sintezi prvog lanca koristite prajmere specifične za gen, umjesto slučajnih prajmera ili oligo (dT). U prvih nekoliko ciklusa koristite višu temperaturu žarenja, a zatim nižu temperaturu žarenja. Upotrijebite Taq DNA polimerazu s vrućim startom za PCR kako biste poboljšali specifičnost reakcije.

A-2 Loš dizajn gena specifičnih prajmera

—— Slijedite iste principe za dizajn prajmera za pojačanje.

A-3 RNA kontaminirana genomskom DNK

—— Tretirajte RNK s DNZ-om razreda PCR. Postavite kontrolnu reakciju bez obrnute transkripcije za otkrivanje kontaminacije DNA.

A-4 Formiranje temeljnog dimera

—— Dizajnirajte početnice bez komplementarnih sekvenci na 3 'kraju.

A-5 Previsoka Mg²⁺ koncentracija

——Optimizujte Mg²⁺ koncentracija za svaku kombinaciju šablona i prajmera

A-6 Zagađen stranom DNK

—— Koristite vrhove otporne na aerosol i enzime UDG.

A-1 Sadržaj proizvoda prve niti je previsok

—— Smanjite količinu proizvoda prve niti u konvencionalnom koraku PCR reakcije.

A-2 Prevelika količina prajmera u PCR reakciji

——Smanji unos prajmera.

A-3 Previše ciklusa

——Optimizujte uslove reakcije PCR -a i smanjite broj ciklusa PCR -a.

A-4 Preniska temperatura žarenja

——Povećajte temperaturu žarenja kako biste spriječili nespecifično pokretanje i produženje.

A-5 Nespecifična amplifikacija fragmenata oligonukleotida nastalih razgradnjom DNaze DNK-Izdvojite visokokvalitetnu RNK kako biste spriječili kontaminaciju DNK.

RT-PCR treba obrnuto transkribovati RNK u cDNK, a zatim koristiti obrnuto transkribovanu cDNK kao obrazac za PCR reakciju za amplifikaciju ciljnog fragmenta. Odaberite nasumične prajmere, oligo dT i genetski specifične prajmere prema specifičnim uvjetima eksperimenta. Svi gore navedeni početni premazi mogu se koristiti za kratku eRK ćelijsku mRNA bez strukture ukosnice.

Slučajni prajmer: Pogodan za dugu RNK sa strukturom ukosnice, kao i za sve vrste RNK kao što su rRNK, mRNK, tRNK itd. Uglavnom se koriste za RT-PCR reakciju pojedinačnog uzorka.

Oligo dT: Pogodno za RNA sa PolyA repom (prokariotska RNA, eukariotska oligo dT rRNA i tRNA nemaju PolyA repove). Budući da je Oligo dT vezan za PolyA rep, kvaliteta uzoraka RNA mora biti visoka, pa čak i mala količina razgradnje uvelike će smanjiti količinu sinteze cDNA pune dužine.

Genetski specifični prajmer: Komplementaran sa šablonom sekvence, pogodan za situacije u kojima je poznata ciljna sekvenca.

Postoje dva načina:

1. Interna referentna metoda: U teoriji, cDNA su fragmenti DNK različite dužine, pa je rezultat elektroforeze bris. Ako je brojnost RNK niska, u elektroforezi se neće prikazati niti jedan proizvod, ali to ne znači da niti jedan proizvod neće biti pojačan PCR -om. Općenito, interna referenca se može koristiti za otkrivanje cDNA. Ako interna referenca daje rezultate, kvaliteta cDNA može se u osnovi zajamčiti (u nekoliko slučajeva, ako je fragment ciljnog gena predug, mogu postojati izuzeci).

2. Ako postoji poznati gen pojačan ovim šablonom, to se može provjeriti početnicama ovog gena. Pojačavanje interne reference ne znači nužno da nema problema sa cDNA. Budući da interna referenca ima veliku količinu cDNA, lako ju je pojačati. Ako se cDNA djelomično razgradi iz različitih razloga, iz perspektive vjerojatnosti, rezultati PCR -a ciljanih gena male zastupljenosti bit će uvelike pogođeni. Iako je internih referenci još uvijek u izobilju, pojačanje vjerojatno neće biti pogođeno.

Delimična degradacija RNK. Otkrijte integritet i pročistite RNK

Sadržaj RNK različitih vrsta može biti različit, ali općenito, ekstrahirana ukupna RNK trebala bi sadržavati dvije jasne trake 28S i 18S u elektroforezi u gelu, a svjetlina prve trake trebala bi biti dvostruko veća od one druge. 5S pojas ukazuje na to da je RNK degradirana, a njezina svjetlina je proporcionalna stepenu degradacije. Uspješno pojačavanje interne reference ne znači da nema problema s RNK, jer je interna referenca u velikom broju, RNA se može pojačati sve dok razgradnja nije ozbiljna. OD₂₆₀/OD₂₈₀omjer čiste RNK izmjeren spektrofotometrom trebao bi biti između 1,9 i 2,1. Mala količina proteinske nečistoće u RNK će smanjiti omjer. Sve dok vrijednost nije preniska, to neće utjecati na RT. Ono što je najvažnije za RT je integritet RNK.

Proširenje internog referentnog gena može samo ukazivati ​​na to da je RT uspjelo, ali nije nužno povezano s kvalitetom lanca cDNA. Budući da su interni referentni fragmenti općenito male veličine i izraziti, lakše je postići uspjeh u obrnutoj transkripciji. Međutim, veličina i ekspresija ciljnog gena variraju od gena do gena. Kvalitet cDNA ne može se procijeniti samo internom referencom, posebno za ciljne fragmente duže od 2 kb.

Neki uzorci imaju složene sekundarne strukture, ili imaju bogat sadržaj GC -a, ili su dragocjeni s malom količinom. U tim slučajevima, odgovarajuću reverznu transkriptazu treba odabrati prema veličini ciljnog fragmenta i uzorka. Za šablone RNK s visokim sadržajem GC -a i složenom sekundarnom strukturom, teško je otvoriti sekundarnu strukturu na niskoj temperaturi ili s uobičajenom reverznom transkriptazom. Za ove šablone može se odabrati Quant Reverse Transcriptase, budući da su njezine performanse obrnute transkripcije očito bolje od one reverzne transkriptaze serije M-MLV, koja može efikasno preokrenuti različite RNA šablone i maksimalno prepisati RNA u prvu lanac cDNA. Kada se koristi opći komplet reverzne transkriptaze, sistem od 20 μl može efikasno preokrenuti samo 1 μg ukupne RNK. Molimo obratite pažnju na maksimalni RT kapacitet kompleta. Ako se šablon doda u višku, reverzna transkripcija će favorizirati RNK sa velikom količinom. Stoga je bolje ne prelaziti maksimalni kapacitet sistema.

A-1 Utvrditi je li RNA ozbiljno razgrađena i je li RT uspješan

Općenito, razlog neuspjeha internog referentnog pojačanja često je uzrokovan ozbiljnom degradacijom RNK. Drugi mogući razlog je neuspjeh obrnute transkripcije. Interna referenca ne može se koristiti kao standard za procjenu kvalitete cDNA jednolančane, ali se može koristiti kao standard za procjenu je li reverzna transkripcija uspješna ako nema problema s kvalitetom RNA. Najvažnija stvar u procesu obrnute transkripcije je održavanje konstantne temperature i konstantnog reakcijskog sistema kako bi se poboljšala efikasnost reakcije.

A-2 Utvrdite da li su prajmeri za amplifikaciju internih referentnih gena pouzdani i ima li problema sa reagensima koji se koriste u PCR-u.

Radi relativne kvantifikacije, RNA se mora kvantificirati prije reverzne transkripcije, što je također potrebno u mnogim kompletima reverzne transkripcije, na primjer, kvantificirati unos RNA kao 1 μg. Budući da je obrnuto transkribirana cDNA mješovita otopina, uključujući RNK, oligo dT, enzim, dNTP, pa čak i malo DNK ostatka, doći će do odstupanja, pa je nemoguće precizno kvantificirati cDNA. Stoga je neophodna kvantifikacija RNK. S obzirom na to da je efikasnost obrnute transkripcije ista među različitim uzorcima, količina dobivene cDNA trebala bi biti ista, a kvantitativna analiza može pokazati upoređivanje nivoa ekspresije različitih gena u istoj količini ukupne RNK. Prilikom izvođenja relativne fluorescentne kvantitativne PCR, kvantitativna cDNA možda neće biti potrebna nakon obrnute transkripcije jer se interni referentni gen može ponašati kao referentni.

Uglavnom se odnosi na gene, a obrnuta transkripcija dugog fragmenta nije izvediva za većinu gena. Prvo, efikasnost obrnute transkripcije je daleko niža od PCR. Drugo, regija bogata GC -om i sekundarna struktura mnogih gena ograničavaju i obrnutu transkripciju i PCR. Konačno, vjernost i efikasnost amplifikacije PCR -a teško je garantovati u isto vrijeme. U procesu obrnute transkripcije, niko ne može garantovati da će dobiti dugačke fragmente za gene sa niskom kopijom, posebno koristeći oligo dT. Što se tiče 5 'UTR s više GC -a, to je još teže. Stoga je još uvijek razumna metoda obrnuti transkript nasumičnim početnicama, pronaći mjesta prirodnog cijepanja u ciljnom fragmentu, pojačati po segmentima, a zatim izvršiti restrikcijsku probavu i ligaciju. Općenito, teško je izravno amplificirati fragmente veće od 2 kb, ali nije uvijek nemoguće dobiti: 1. Prije svega, jamčite integritet RNA/mRNA, a poželjna je ekstrakcija TRIZOL -a. 2. M-MLV RT-PCR komplet se može direktno koristiti. Produžite vrijeme žarenja i pravilno povećajte broj ciklusa u procesu pojačanja. Alternativno, može se primijeniti ugniježđeni PCR ili prvo provesti jednu ili dvije reakcije s odgovarajuće produženim vremenom denaturacije i produženja prije normalne PCR amplifikacije, što može pomoći u produženju fragmenata. Obratite pažnju na vjernost polimeraze. 3. Dugi Taq se može koristiti u PCR -u za postizanje idealnih rezultata. 4. Za primjenu ekspresije proteina treba primijeniti polimerazu visoke vjernosti.

TIANGEN nudi dvije vrste reverzne transkriptaze: Quant/King RTase i TIANScript M-MLV. Glavna razlika između njih je ulazna količina predložaka. Quant je jedinstvena reverzna transkriptaza, koja se razlikuje od uobičajeno korištenog M-MLV-a izvedenog iz virusa Moloney mišje leukemije. Quant je nova visokoučinkovita reverzna transkriptaza rekombinantno izražena inženjeringom Escherichia coli. Quant je pogodan za amplifikaciju 50 ng-2 μg RNA sa visokom reverznom transkripcionom aktivnošću i visokim prinosom. U usporedbi s običnim MMLV -om ili AMV -om, najveća Quantova karakteristika je da ima vrlo snažan afinitet prema RNA šablonima i može preokrenuti složene predloške transkripta bez denaturacije na visokoj temperaturi. Za predloške s većim sadržajem GC -a, obrnuta efikasnost je veća. Međutim, ova reverzna transkriptaza ima aktivnost RNaze H, što može utjecati na dužinu cDNA proizvoda (pogodno za šablone <4,5 kb). Za konvencionalnu reverznu transkripciju preporučuje se TIANScript MMLV reverzna transkriptaza. Ova RTaza je modificirani enzim sa vrlo slabom aktivnošću RNaze H, koji je pogodan za dugu (> 5 kb) sintezu cDNA.

Jednostepena reverzna transkripcija i PCR amplifikacija završavaju se u istoj epruveti bez otvaranja poklopca cijevi između sinteze i amplifikacije cDNA, što je korisno za smanjenje kontaminacije. Budući da se svi dobijeni uzorci cDNA koriste za amplifikaciju, osjetljivost je veća, s minimalno 0,01 pg ukupne RNA. Za uspješan jednofazni RTPCR, genetski specifični prajmeri se općenito koriste za pokretanje sinteze cDNA. Metoda u dva koraka, naime reverzna transkripcija i PCR amplifikacija, izvodi se u dva koraka. Prvo se vrši reverzna transkripcija iz RNA šablona kako bi se dobila cDNA, a dobivena cDNA se podvrgava jednoj ili više različitih PCR reakcija. Metoda u dva koraka može koristiti oligo (dT) ili nasumične prajmere za usmjeravanje sinteze prvog lanca cDNA i može obrnuto prepisati sve informacije mRNA iz određenog uzorka.