2 × Pfu PCR mix

A-1 Template

■ Predložak sadrži proteinske nečistoće ili inhibitore Taq, itd. - Očistite predložak DNK, uklonite proteinske nečistoće ili izvadite DNK šablona kompletima za pročišćavanje.

■ Denaturacija šablona nije potpuna —— Odgovarajuće povećati temperaturu denaturacije i produžiti vreme denaturacije.

■ Degradacija predloška ——Ponovo pripremite predložak.

A-2 Primer

■ Loš kvalitet prajmera —— Ponovo sintetizujte prajmer.

■ Razgradnja prajmera —— Raspodijelite prajmere velike koncentracije u mali volumen radi očuvanja. Izbjegavajte višestruko zamrzavanje i odmrzavanje ili dugotrajno krio konzerviranje na 4 ° C.

■ Nepravilno oblikovanje prajmera (npr. Dužina prajmera nije dovoljna, dimer formiran između prajmera itd.) -Preizmenjivanje prajmera (izbegavanje stvaranja dimera prajmera i sekundarne strukture)

A-3 Mg²⁺koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija je preniska —— Pravilno povećajte Mg²⁺ koncentracija: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM sa intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalnog Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

A-4 Temperatura žarenja

■ Visoka temperatura žarenja utiče na vezivanje temeljnog premaza i šablona. ——Smanjite temperaturu žarenja i optimizirajte stanje s gradijentom od 2 ° C.

A-5 Vreme produženja

■ Kratko vreme produženja —— Produžite vreme produženja.

Fenomeni: Negativni uzorci također pokazuju trake ciljnih sekvenci.

A-1 Kontaminacija PCR-om

■ Ukrštena kontaminacija ciljane sekvence ili produkata amplifikacije —— Pažljivo ne pipetirajte uzorak koji sadrži ciljnu sekvencu u negativnom uzorku ili ih prosipajte iz epruvete za centrifugu. Reagense ili opremu treba autoklavirati kako bi se uklonile postojeće nukleinske kiseline, a postojanje kontaminacije treba utvrditi eksperimentima s negativnom kontrolom.

■ Kontaminacija reagensa —— Rasporedite reagense i čuvajte na niskoj temperaturi.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ koncentracija je preniska —— Pravilno povećajte Mg²⁺ koncentracija: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM sa intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalnog Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

■ Nepravilan dizajn prajmera, a ciljna sekvenca ima homologiju sa sekvencom bez cilja. —— Premazi za ponovni dizajn.

Fenomeni: PCR amplifikacijske trake nisu u skladu s očekivanom veličinom, bilo velike ili male, ili se ponekad javljaju i specifične pojačane pojaseve i nespecifične pojačane pojaseve.

A-1 Primer

■ Loša specifičnost prajmera

—— Premaz za ponovno oblikovanje.

■ Koncentracija prajmera je previsoka —— Pravilno povećajte temperaturu denaturacije i produžite vrijeme denaturacije.

A-2 Mg²⁺ koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija je previsoka —— Pravilno smanjite koncentraciju Mg2+: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM sa intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalnog Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

A-3 Termostabilna polimeraza

■ Prekomjerna količina enzima —— Smanjite količinu enzima na odgovarajući način u intervalima od 0,5 U.

A-4 Temperatura žarenja

■ Temperatura žarenja je preniska —— Odgovarajuće povećajte temperaturu žarenja ili usvojite dvostepenu metodu žarenja

A-5 PCR ciklusi

■ Previše PCR ciklusa —— Smanjite broj PCR ciklusa.

A-1 Primer—— Loša specifičnost ——Projektirajte temeljni premaz, promijenite položaj i dužinu prajmera kako biste poboljšali njegovu specifičnost; ili izvršite ugniježđenu PCR.

A-2 DNK šablona

—— Predložak nije čist—— Očistite predložak ili izvucite DNK setovima za pročišćavanje.

A-3 Mg²⁺ koncentracija

——Mg²⁺ koncentracija je previsoka —— Pravilno smanjite Mg²⁺ koncentracija: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM sa intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalnog Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

A-4 dNTP

—— Koncentracija dNTP -a je previsoka —— Smanjite koncentraciju dNTP -a na odgovarajući način

A-5 Temperatura žarenja

—— Preniska temperatura žarenja —— Odgovarajuće povećajte temperaturu žarenja

A-6 Ciklusi

—— Previše ciklusa ——Optimizirajte broj ciklusa

Prvi korak je odabir odgovarajuće polimeraze. Obična Taq polimeraza ne može se lektorisati zbog nedostatka 3'-5 'egzonukleazne aktivnosti, a neusklađenost će u velikoj mjeri smanjiti efikasnost produženja fragmenata. Stoga, obična Taq polimeraza ne može učinkovito pojačati ciljane fragmente veće od 5 kb. Taq polimerazu sa posebnom modifikacijom ili drugu polimerazu visoke vjernosti treba odabrati kako bi se poboljšala efikasnost produženja i zadovoljile potrebe pojačanja s dugim fragmentima. Osim toga, pojačavanje dugih fragmenata također zahtijeva odgovarajuće prilagođavanje dizajna prajmera, vrijeme denaturacije, vrijeme produženja, pH pufera itd. Obično prajmeri sa 18-24 bp mogu dovesti do boljeg prinosa. Kako bi se spriječilo oštećenje šablona, ​​vrijeme denaturacije na 94 ° C treba smanjiti na 30 sekundi ili manje po ciklusu, a vrijeme za povećanje temperature na 94 ° C prije pojačanja treba biti manje od 1 minute. Štaviše, postavljanje ekstenzijske temperature na oko 68 ° C i dizajniranje produžetnog vremena prema brzini od 1 kb/min može osigurati efikasno pojačavanje dugih fragmenata.

Stopa grešaka amplifikacije PCR -a može se smanjiti upotrebom različitih DNA polimeraza visoke vjernosti. Među svim do sada pronađenim Taq DNK polimerazama, Pfu enzim ima najmanju stopu grešaka i najveću vjernost (vidi priloženu tabelu). Osim odabira enzima, istraživači mogu dodatno smanjiti brzinu mutacije PCR -a optimiziranjem reakcijskih uvjeta, uključujući optimiziranje sastava pufera, koncentraciju termostabilne polimeraze i optimiziranje broja ciklusa PCR -a.