Blood Direct PCR Kit

Brzo pojačavanje ciljnog gena izravno pomoću krvi kao uzorka bez ekstrakcije.

Ovaj komplet usvaja genetski modifikovanu anti-inhibitornu DNK polimerazu za efikasno pojačavanje gena za jednu kopiju u ljudskom genomu. Dobro optimiziran puferski sistem u ovom kompletu pomaže polimerazi da se snažno odupre inhibiciji PCR inhibitora, pa može izravno pojačati DNA koristeći krv i kultivirane ćelije kao šablone. Ovaj proizvod je jednostavan za rukovanje i ne zahtijeva složene korake poput čišćenja DNK ili predtretmana uzoraka.
Ovaj komplet se isporučuje kao 2 × MasterMix, a reakcija se može izvesti jednostavnim dodavanjem uzorka krvi i odgovarajućih detekcijskih prajmera. Može se primijeniti na uzgojene stanice sisavaca, poput ljudi, miševa, svinja, goveda i drugih vrsta, kao i na svježu ili 4 ℃ krioprezerviranu punu krv, antikoagulant (EDTA, citrat, heparin), ukapljene krvne ugruške i suhe krvne mrlje pohranjene na komercijalnim karticama Whatman 903 i FTA Elute.

Cat. Ne	Veličina pakovanja
4992529	20 µl × 100 rxn
4992530	20 µl × 500 rxn

Pošaljite nam e -poruku

Detalji o proizvodu

Eksperimentalni primjer

FAQ

Oznake proizvoda

Karakteristike

■ Jednostavno i brzo: PCR amplifikacija se može izvesti direktno pomoću krvi kao uzorka, bez potrebe za mukotrpnim koracima pripreme uzorka i ekstrakcije DNK.
■ Visoka čistoća: Preskakanje koraka prethodne obrade uzorka i ekstrakcije DNK može pomoći u izbjegavanju unakrsne kontaminacije uzoraka.
■ Visoka propusnost: PCR identifikacija za velike uzorke može se izvesti kombiniranjem kompleta sa PCR pločama sa 96/384 jažica.
■ Snažna univerzalnost: Ovaj komplet može efikasno pojačati fragmente visokog GC -a ili fragmente sa složenom sekundarnom strukturom, a dužina pojačanja može biti do 5 kb.
■ Snažna otpornost na stres: Ovaj komplet se može primijeniti na različite vrste i uzorke krvi sačuvane na različite načine.

Aplikacije

PCR proizvodi ovog kompleta sadrže "A" na 3'-kraju, koji se može direktno koristiti za kloniranje TA vektora. Ovaj komplet se može koristiti za amplifikaciju genomskih fragmenata DNK, visokopropusnu genetsku analizu i analizu genotipizacije (kao što je otkrivanje gena).

Svi proizvodi se mogu prilagoditi za ODM/OEM. Za detalje,kliknite Prilagođena usluga (ODM/OEM)

Prethodno: TIANcombi DNA Lyse & Det PCR komplet

Sljedeći: Direktni PCR komplet za mišje tkivo

	Koristeći humanu EDTA antikoagulaciju kao šablon, 4 gena s različitim sadržajem GC -a su amplificirana pomoću Blood Direct PCR Kit. PCR reakcijski sistem bio je 20 μl, a 1 μl krvi korištena je kao šablon. M: TIANGEN Marker II; 1: Veličina fragmenta 1090 bp, sadržaj GC 68,1%; 2: Veličina fragmenta 1915 bp, sadržaj GC 70,4%; 3: Veličina fragmenta 448 bp, sadržaj GC 74,8%; 4: Veličina fragmenta 1527 bp, sadržaj GC 61,5%. Eksperimentalni rezultati: Blood Direct PCR Kit može učinkovito pojačati fragmente DNA sa sadržajem GC-a u rasponu od 61,5%-74,8%, što sugerira da je sposoban za pojačavanje fragmenata visokog GC-a.
	Koristeći humanu EDTA antikoagulaciju kao šablon, 5 gena različite dužine (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 i Hn4.0) je amplificirano pomoću Blood Direct PCR Kit -a. PCR reakcijski sistem bio je 20 μl, a 1 μl krvi korištena je kao šablon. M: TIANGEN Marker II; 1-3: 3 različita uzorka krvi; NTC: upravljanje bez prajmera. Eksperimentalni rezultati: Blood Direct PCR Kit može pojačati fragmente dužine čak 4 kb, što sugerira da je sposoban za amplifikaciju dugih fragmenata.
	Koristeći humanu EDTA antikoagulaciju kao šablon, Blood Direct PCR Kit je korišten za PCR detekciju različitih uzoraka krvi. PCR reakcijski sistem bio je 20 μl, a 1 μl krvi korištena je kao šablon. M: TIANGEN Marker II; 1-9: količina punjenja krvi je 0,1 μl, 0,2 μl, 0,3 μl, 0,4 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl i 5 μl, respektivno; NTC: kontrola bez predloška Eksperimentalni rezultati: Blood Direct PCR Kit ima jaku otpornost na krv i može pojačati uzorke krvi s rasponom punjenja od 0,1-5 μl.
	Kao uzorci su korišteni uzorci krvi ljudi, pacova, piletine i drugih vrsta sa različitim tretmanima. Blood Direct PCR Kit korišten je za pojačavanje PRNP (humani, 750 bp), Actin (pacov, 200 bp) i β-Actin (piletina, 1,0 kb). PCR reakcijski sistem bio je 20 μl, a 1 μl krvi korištena je kao šablon. M: TIANGEN Marker II. Eksperimentalni rezultati: Blood Direct PCR Kit može se primijeniti na širok raspon uzoraka, a izravno PCR otkrivanje može se provesti na uzorcima krvi različitih vrsta s različitim tretmanima.

P: Nema pojaseva pojačanja

A-1 Template

■ Predložak sadrži proteinske nečistoće ili inhibitore Taq, itd. - Očistite predložak DNK, uklonite proteinske nečistoće ili izvadite DNK šablona kompletima za pročišćavanje.

■ Denaturacija šablona nije potpuna —— Odgovarajuće povećati temperaturu denaturacije i produžiti vreme denaturacije.

■ Degradacija predloška ——Ponovo pripremite predložak.

A-2 Primer

■ Loš kvalitet prajmera —— Ponovo sintetizujte prajmer.

■ Razgradnja prajmera —— Raspodijelite prajmere velike koncentracije u mali volumen radi očuvanja. Izbjegavajte višestruko zamrzavanje i odmrzavanje ili dugotrajno krio konzerviranje na 4 ° C.

■ Nepravilno oblikovanje prajmera (npr. Dužina prajmera nije dovoljna, dimer formiran između prajmera itd.) -Preizmenjivanje prajmera (izbegavanje stvaranja dimera prajmera i sekundarne strukture)

A-3 Mg²⁺koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija je preniska —— Pravilno povećajte Mg²⁺koncentracija: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM sa intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalnog Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

A-4 Temperatura žarenja

■ Visoka temperatura žarenja utiče na vezivanje temeljnog premaza i šablona. ——Smanjite temperaturu žarenja i optimizirajte stanje s gradijentom od 2 ° C.

A-5 Vreme produženja

■ Kratko vreme produženja —— Produžite vreme produženja.

P: Lažno pozitivan

Fenomeni: Negativni uzorci također pokazuju trake ciljnih sekvenci.

A-1 Kontaminacija PCR-om

■ Ukrštena kontaminacija ciljane sekvence ili produkata amplifikacije —— Pažljivo ne pipetirajte uzorak koji sadrži ciljnu sekvencu u negativnom uzorku ili ih prosipajte iz epruvete za centrifugu. Reagense ili opremu treba autoklavirati radi uklanjanja postojećih nukleinskih kiselina, a postojanje kontaminacije treba utvrditi eksperimentima s negativnom kontrolom.

■ Kontaminacija reagensa —— Rasporedite reagense i čuvajte na niskoj temperaturi.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ koncentracija je preniska —— Pravilno povećajte Mg²⁺ koncentracija: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM sa intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalnog Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

■ Nepravilan dizajn prajmera, a ciljna sekvenca ima homologiju sa sekvencom bez cilja. —— Premazi za ponovni dizajn.

P: Nespecifično pojačanje

Fenomeni: PCR amplifikacijske trake nisu u skladu s očekivanom veličinom, bilo velike ili male, ili se ponekad javljaju i specifične pojačane pojaseve i nespecifične pojačane pojaseve.

A-1 Primer

■ Loša specifičnost prajmera

—— Premaz za ponovno oblikovanje.

■ Koncentracija prajmera je previsoka —— Pravilno povećajte temperaturu denaturacije i produžite vrijeme denaturacije.

A-2 Mg²⁺ koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija je previsoka —— Pravilno smanjite koncentraciju Mg2+: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM sa intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalnog Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

A-3 Termostabilna polimeraza

■ Prekomjerna količina enzima —— Smanjite količinu enzima na odgovarajući način u intervalima od 0,5 U.

A-4 Temperatura žarenja

■ Temperatura žarenja je preniska —— Odgovarajuće povećajte temperaturu žarenja ili usvojite dvostepenu metodu žarenja

A-5 PCR ciklusi

■ Previše PCR ciklusa —— Smanjite broj PCR ciklusa.

P: Zakrpljene ili razmazane trake

A-1 Primer—— Loša specifičnost ——Projektirajte temeljni premaz, promijenite položaj i dužinu prajmera kako biste poboljšali njegovu specifičnost; ili izvršite ugniježđenu PCR.

A-2 DNK šablona

—— Predložak nije čist—— Očistite predložak ili izvucite DNK setovima za pročišćavanje.

A-3 Mg²⁺ koncentracija

——Mg²⁺ koncentracija je previsoka —— Pravilno smanjite Mg²⁺ koncentracija: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracija nizom reakcija od 1 mM do 3 mM sa intervalom od 0,5 mM za određivanje optimalnog Mg²⁺ koncentracija za svaki predložak i temeljni premaz.

A-4 dNTP

—— Koncentracija dNTP -a je previsoka —— Smanjite koncentraciju dNTP -a na odgovarajući način

A-5 Temperatura žarenja

—— Preniska temperatura žarenja —— Odgovarajuće povećajte temperaturu žarenja

A-6 Ciklusi

—— Previše ciklusa ——Optimizirajte broj ciklusa

P: Koliko DNK uzorka treba dodati u 50 μl PCR reakcijski sistem?

P: Kako pojačati dugačke fragmente?

Prvi korak je odabir odgovarajuće polimeraze. Obična Taq polimeraza ne može se lektorisati zbog nedostatka 3'-5 'egzonukleazne aktivnosti, a neusklađenost će u velikoj mjeri smanjiti efikasnost produženja fragmenata. Stoga, obična Taq polimeraza ne može učinkovito pojačati ciljane fragmente veće od 5 kb. Taq polimerazu sa posebnom modifikacijom ili drugu polimerazu visoke vjernosti treba odabrati kako bi se poboljšala efikasnost produženja i zadovoljile potrebe pojačanja s dugim fragmentima. Osim toga, pojačavanje dugih fragmenata također zahtijeva odgovarajuće prilagođavanje dizajna prajmera, vrijeme denaturacije, vrijeme produženja, pH pufera itd. Obično prajmeri sa 18-24 bp mogu dovesti do boljeg prinosa. Kako bi se spriječilo oštećenje šablona, vrijeme denaturacije na 94 ° C treba smanjiti na 30 sekundi ili manje po ciklusu, a vrijeme za povećanje temperature na 94 ° C prije pojačanja treba biti manje od 1 minute. Štaviše, postavljanje ekstenzijske temperature na oko 68 ° C i dizajniranje produžetnog vremena prema brzini od 1 kb/min može osigurati efikasno pojačavanje dugih fragmenata.

P: Kako poboljšati vjernost amplifikacije PCR -a?

Stopa grešaka amplifikacije PCR -a može se smanjiti upotrebom različitih DNA polimeraza visoke vjernosti. Među svim do sada pronađenim Taq DNK polimerazama, Pfu enzim ima najmanju stopu grešaka i najveću vjernost (vidi priloženu tabelu). Osim odabira enzima, istraživači mogu dodatno smanjiti brzinu mutacije PCR -a optimiziranjem reakcijskih uvjeta, uključujući optimiziranje sastava pufera, koncentraciju termostabilne polimeraze i optimiziranje broja ciklusa PCR -a.

Ovdje napišite svoju poruku i pošaljite nam je